微量法

正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

测定原理：

肌酸激酶催化肌酸和ATP反应生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸含量，以此反应ATP含量。

自备仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂组成和配制：

酸性提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 支，4℃保存；临用加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃ 保存；

试剂二：液体 1.5mL×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用加入 500μL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

标准液：液体 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 标准液，4℃保存；

ATP 提取：

1、血清（浆）中ATP的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min；取上清液至另一EP管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g4 ℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

2、组织中 ATP 的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

3、细胞或细菌中ATP的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 酸性提取液），超声波破碎1min（冰浴，强度20％或200W，超声2s，停1s），8000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。