免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等,可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞: 可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培养细胞,然后到预定时间时进行固定等后续操作。
也可以用洁净的盖玻片,70%乙醇中浸泡后,用无菌的镊子放置到6孔板内,然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养,待细胞贴在盖玻片上生长良好后,即可进行固定等后续操作。
对于悬浮细胞: 把细胞先在固定液中固定,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳,可以在载玻片上用PDL等物质进行处理,以增强载玻片的粘附能力。
对于冷冻切片: 切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。
对于石蜡切片: 脱蜡:切片在二甲苯中脱蜡5分钟,再换用新鲜的二甲苯脱蜡,共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟,两次。90%乙醇5分钟,两次,70%乙醇5分钟,一次。蒸馏水5分钟,两次。
抗原修复:根据不同的抗原和抗体,可以选择把切片放置在如下抗原修复液中,10mM柠檬酸钠,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris, pH10.0,95℃加热12分钟,大约在30分钟内缓慢冷却至室温。
3. 封闭(Blocking) 从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则易产生较高的背景。
在整个免疫染色过程中我们推荐使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落,也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行,即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动,但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。加入免疫染色洗涤液, 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书,按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗,或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入免疫染色洗涤液, 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色,此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物,或AB检测体系等进行后续检测。
7. 多重染色(Multiple staining) 如果进行的是免疫荧光染色,通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应,例如DAB染色,一般不适合再进行多重染色。
多重荧光染色: 可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。
用HE染色进行复染: 原创作者:上海雅吉生物科技有限公司 |