| 在做荧光定量PCR实验时，有个很重要的概念，就是“CT值”。有经验的同学会根据CT值的范围来初步判断这个实验结果是否合理。 那么，什么是CT值呢？CT在什么范围内比较好呢？ CT，是Cycle Threshold的简写，一般译为“循环阈值”（阈，读音yù，外门内或，不要误以为“阀”哦）。简单说，这是一个临界点。在这个点之，荧光曲线是近乎“平”的，从这个点开始，荧光曲线忽然开始耸立起来（俗称为“起飞”），进入了传说中的“指数增期”。不同样品、不同基因的CT值都有可能不同的。而这个点所对应的循环数值，就是后来我们进行基因含量计算的重要依据。见下图： 在荧光定量PCR实验中常有一个内参基因作为你的目的基因的参照。这样，你在结果中应该关注两个CT值：一是你的目的基因的CT值；二是内参基因的CT值。 常见的荧光定量PCR实验，循环数多半设定为40个。一般认为，CT值太大或者太小，都是不可信的。如果太小，比如小于10，则因为在此阶段荧光读值还不是很稳定，所以读到的值有可能不准。如果太大，比如大于35，则反应的随机性增大、三复孔间的误差可能会比较大，而且有可能伴随有非特异性产物的影响。 一般认为，内参基因的表达量比较高，通常远大于目的基因。内参基因的CT值要大于10——接近于20，目的基因的CT在20几到30左右（通常小于35），都是比较理想的范围。这样的CT值算出的结果是可信的。 如果你得到的CT值落在这个范围之外，太大或太小，就要小心结果有可能不准。 常见解决办法，调整一下模板DNA的浓度，提高或者降低模板DNA的浓度，会相应改变CT值，终使之处于一个合理的范围内。这样的结果才是可信的。见下图： 顺带说一下：我们平时得到的CT值是仪器使用默认参数下给出的。实际上这些参数我们是可以人为进行调整的。 比如图一和图二中的阈值（即Threshold这条横线）的高度，在软件中其实是可以手动调节的。个别情况下有可能需要这样的操作。这样得出的CT值就会略有不同。当然，如果你的实验结果比较确的话，这样的调整并不会改变目的基因与内参基因的相对关系，所以终算出的结果——即相对趋势——并不会有本质上的变化。 原创作者：上海雅吉生物科技有限公司 |
