一、样品DNA的制备 1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。 2. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的天净沙DNA释放剂,本产品的裂解液可以直接作为PCR模板,省略了DNA提取步骤。 二、设置PCR反应(40 μL体系) 3. 对N+2个样品,在PCR时需要增加一个PCR阳性对照和一个PCR阴性对照,故需要设置N+4个反应。在N+4个PCR管中分别加入下列成分: 成分 | N+2个 样品管 | PCR阴性对照 | PCR阳性对照 | PCR MagicMix 3.0 | 各20 μL | 20 μL | 20 μL | 炭疽芽孢杆菌 PCR引物混合液 | 各2 μL | 2 μL | 2 μL | N+2个样品DNA模板 | 各18 μL | - | - | 样品制备阴性对照 | - | 18 μL | - | 样品制备阳性对照 | - | - | 18 μL | 4. 按下表设置PCR反应: 过程 | 温度 | 时间 | 预变性 | 94℃ | 5 min | PCR反应 (35个循环) | 94℃ | 20 sec | 50℃ | 20 sec | 72℃ | 30 sec | *后延伸 | 72℃ | 10 min | 三、电泳检测 5. 取10-20 μL PCR产物。电泳检测PCR产物。本产品提供的PCR Mix在扩增结束后可以直接上样,不需要另外再加loading buffer。预期的PCR产物长度为208bp。阳性对照必须有此条带出现,阴性对照必须无任何扩增,否则实验无效。对没有扩增产物的样品,可以稀释10倍后重复PCR扩增以排除PCR抑制剂的感染。 |