一、稀释标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。 1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。 2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)。 3. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品DNA的制备 7. 如果有N个样品,设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。 8. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数鞭毛虫DNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的天净沙核酸释放剂,本产品的裂解液可以直接作为PCR模板,省略了DNA提取步骤。 三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 9. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液,浓度为10000拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后*后加): 成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管(2-7管) | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 蓝氏贾第鞭毛虫探针法qPCR探针 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 蓝氏贾第鞭毛虫探针法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) | 11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR: 过程 | 温度 | 时间 | 预变性 | 95℃ | 10 min | PCR反应 (40个循环) | 95℃ | 15 sec | 60℃ | 60 sec(采集FAM通道的荧光信号) | 五、数据处理 12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。 13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。 |