大肠埃希氏菌(O157：H7)荧光定量 PCR 检测试剂盒

产品及特点

大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌（Escherichia   coli），属于革兰氏阴性细菌。

大肠杆菌 O157:H7 是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia

coli, EHEC)的*常见类型，O 表示抗原类型, H7 表示血清型。其感染剂量极低，

人体只要摄入 10 个细菌就可以致病，目前还没有特效疫苗，因此大量开展预防

检测工作具有重要的意义。目前对 O157 的检测主要是传统分离培养、免疫学

和分子水平的 PCR 检测。本试剂盒就是利用实时荧光定量 PCR 技术开发的大

肠杆菌 O157:H7 检测试剂盒，它通过荧光染料实时显示样品模板 DNA 的量，

并通过坐标曲线表示出来，结果直观准确。它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

2.荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。

3.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分

编号

50 次塑料袋包装

2×qPCR Mix

90408

1.0 mL

O157:H7 专一性引物对

yw13851386

200 μL

O157:H7 阳性对照，

XXX 10E9 拷贝/μL

yw13871388

100 μL

超纯水

100935

1 mL

使用手册

1 份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

自备试剂

样品等

使用方法

一、样品 DNA 的制备

用自选方法提取细菌样品 DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的

关键因素。如果不能很好纯化样品  DNA，后面的 PCR  再灵敏也不能提高整体检

测灵敏度。

二、制备 O157:H7 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标

准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样

品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品

不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DNA 片段

作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（*好用带芯枪头，下同）。

3.先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到

10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7

拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。

4.在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 O157:H7 阳性对照(上步稀释所

得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。

5.换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5

拷贝/μL 的阳性对照。

6.换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6

个稀释度的阳性对照。

7.NC  管中不加任何阳性对照。

8.从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个

样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，

并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

三、PCR 检测（20 μL 体系）

1.在  PCR  管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次）：

\
 

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR

仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、

RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。

2.建议 PCR 反应参数（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）

过程

温度

时间

预变性

95℃

10 min