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禽网状内皮组织增殖病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

阅读次数:483  发布时间:2019/11/15 9:20:34

 

产品及特点

禽网状内皮组织增殖病病毒(Avian Reticuloendotheliosis VirusREV)会引起网状内皮组织增殖病,是一种鸭、火鸡、鸡和野禽的症状不同的综合征包括免疫抑制、致死性网状细胞瘤、生长抑制综合征(矮小综合征)以及淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤。病毒主要通过水平传播,病鸡的排泄物和分泌物携带病毒,经口感染。新生雏鸡可能由于接种带毒的马立克病疫苗或者通过针头而感染。急性型只表现为死前嗜睡。慢性型表现为矮小综合征,生长发育停滞,羽毛生长不良,冠髯苍白。运动失调,肢体麻痹。该病毒会给养殖业造成较大的经济损失,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点:

1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2. 根据禽网状内皮组织增殖病病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3. 基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。

4. 使用一管式qRT-PCR技术RT和PCR两步在一个试管内完成不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染

5. 产品足够50次30μL体系的RT-PCR只能用于科研,不能用于临床

 

规格及成分

成  份

编号

十孔包装

2×qRT-PCR 缓冲液

190101a

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

190101b

100 μL(红盖)

 ROX染料I

190101c

50 μL(棕色管)

ROX染料II

190101d

50 μL(棕色管)

荧光PCR专用模板稀释液

180701

1mL(亮黄盖)

禽网状内皮组织增殖病病毒RT-PCR引物混合液

14-26500yw

100 μL(白盖)

禽网状内皮组织增殖病病毒RT-PCR阳性对照

(1×10E8拷贝/μL

14-26500pc

50 μL(黄盖)

天净沙核酸释放剂试用装

61202

20次(1mL,绿盖)

使用手册

14-26500sc

1份

 

 

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供DNA片段作为阳性对照。

 

自备试剂

样品RNA

 

使用方法

一、稀释阳性对照(以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)

2. 7号管中加入5 μL 10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头,在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头,在5号管中加入5 μL 10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照)一个是NC样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备阳性对照梯度稀释液中的4浓度为1×10E4拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化N+2样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行

7. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个于上步得到的N+2个样品1个用于PCR阴性对照,6个用标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个于上步得到的N+2个样品1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。

8. 标记管中下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖子后*后加):

成分

N+2制备所得样品

RT-PCR阴性对照

RT-PCR阳性

对照(2-7管)

2×qRT-PCR 缓冲液

10μL

10μL

各10μL

口蹄疫病RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (见注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

 样品制备所得RNA模板(来于8

5.6μL

不加

不加

稀释所得6个阳性对照(来于第6步)

不加

不加

5.6μL(2号样到2号管,3号样到3号管

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

注:需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus

需使用ROX染料II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000

需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler SystemAgilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。

过程

温度

时间

RT逆转录

50℃

15-30分钟

预变性

94℃

2分钟

RT - PCR反应

30个循环)

95℃

15 秒

60

15 秒(采集FAM通道的荧光信号

72

15 秒

仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,推算出其浓度

11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

 

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禽网状内皮组织增殖病病毒可视化RT-LAMP检测试剂盒

 

原创作者:上海雅吉生物科技有限公司

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