一、稀释阳性对照(以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。 1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)。 2. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。 3. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。 4. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品RNA的制备 5. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。 6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。 三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 7. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。 8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后*后加): 成分 | N+2个制备所得样品 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性 对照(2-7管) | 2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各10μL | 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL | 50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL | 样品制备所得RNA模板(来于第8步) | 5.6μL | 不加 | 不加 | 稀释所得6个阳性对照(来于第6步) | 不加 | 不加 | 各5.6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) | 10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL | 注:需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。 需使用ROX染料II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。 9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。 过程 | 温度 | 时间 | RT(逆转录) | 50℃ | 15-30分钟 | 预变性 | 94℃ | 2分钟 | RT - PCR反应 (30个循环) | 95℃ | 15 秒 | 60℃ | 15 秒(采集FAM通道的荧光信号) | 72℃ | 15 秒 | 按仪器预设程序进行溶解曲线分析 | 四、数据处理 10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。 11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。 |