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中肠腺坏死杆状病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒

阅读次数:510  发布时间:2019/11/15 9:25:55

产品及特点

中肠腺坏死杆状病毒(Baculoviral Midgut Gland Necrosis Type Virus,BMNV) 会引发中肠腺坏死杆状病毒病,该病发生在日本对虾幼体。症状主要为病虾中肠腺白浊, 活力差,飘浮在水面。该病毒可以随死亡的上皮细胞破碎后放出病毒粒子,感染其他上皮细胞,在病虾晚期肉眼可见其肝胰腺脏变白,被感染的病虾苗从腹部可见到肝胰腺和中肠腺变白混浊。同时可能有革兰氏阴性菌并发感染,其对成虾的危害相对较小。该病曾造成日本的日本对虾和澳大利亚的斑节对虾幼虾苗损失惨重,在亚洲东部及东南部也有发现,我国在湛江市郊区的日本对虾养殖场也有发现。该病目前尚无特效药物可医治, 必须采取预防措施,因此中肠腺坏死杆状病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用,为此本公司开发了简单快捷的中肠腺坏死杆状病毒染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。

 

2. 根据中肠腺坏死杆状病毒保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。

 

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

 

4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。

 

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

 

6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

规格及成分

 

成分

编号

十孔盒包装

 

 

2×qPCR MagicMix

90408

500μL(棕色管)

 

 

荧光 PCR 专用模板稀释液

180701

1 mL(黄盖)

 

 

中肠腺坏死杆状病毒 PCR 引物混合物

14-59500yw

100μL(白盖

 

 

中肠腺坏死杆状病毒 PCR 阳性对照

 

(1×10E8  拷贝/μL)

 

14-59500pc

 

50μL(红盖

 

 

DNA 病毒裂解液(试用装)

3674a

15 次(9 mL)

 

 

使用手册

14-59500sc

1 份


运输及保存

低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂

DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)

使用方法

一、稀释 PCR 阳性对照 10E2-10E7 拷贝/μL  6  10 倍稀释度为例

 

1.注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

 

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液用带芯枪头,下同

 

4.   7  号管中加入  5  μL  1×10E8  拷贝/μL  的阳性对照,充分震荡  1  分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头,在 6 号管中加入 5  μL  1×10E7 拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所得)充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头,在 5 号管中加入 5  μL  1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

 

二、样品 DNA 的制备

 

8. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照), 一个是 NC(样品制备阴性对照。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4(浓度为 1×10E4  拷贝/μL10μL 相当于 1 万拷贝或第 5 (浓度为 1×10E5拷贝/μL10μL  相当于  10  万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品,则PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

9. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼


容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。

三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行)

 

10. 如果只做 1 次重复,则标记 N+9  PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复,则反应设置数量相应增加 2  3 倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后*后加):
:仅 ABI75007700  7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光 PCR  iCycler IQMJ OptionMJ Chromo4MX3000MX4000RotorGene 3000、RotorGene 6000  LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。

12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行


 

优化)

13. 数据采集

 

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时, 吸收光谱在 471 nm,结合 DNA 时的吸收光谱在 500 nm,发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

 

14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值,再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于  40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct  值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则

为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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原创作者:上海雅吉生物科技有限公司

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