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单克隆抗体的制备方法

阅读次数:319  发布时间:2020/9/11 9:11:06
 单克隆抗体在现代生物医学中的作用越来越大,它不仅被广泛应用于生化和免疫检测,而且治疗癌症和自体免疫疾病的单抗药物也逐渐批准上市。因此单抗的制备和筛选具有其内在的重要性。
 
动物免疫
取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原(20 μg/只),次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化,0.2 mL/只;两周后进行第二次免疫,抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化,皮下注射,0.2 mL/只;两周后进行第三次免疫,免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,第三次免疫两周后,选择效价的小鼠,用不加佐剂的抗原加强免疫,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。
 
细胞融合
1 骨髓瘤细胞的准备
选择生长状态良好的SP2/0细胞,覆盖瓶底80%时弃上清,以不完全培养基洗涤一次后,用l0 mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。
 
2 脾淋巴细胞的准备
取加强免疫后3天的小鼠,摘除眼球采血作为阳性血清;颈脱臼将小鼠致死,用75%酒精消毒体表10 min,随即放入超净台内的解剖板上,腹部朝上,四肢固定;无菌打开腹腔取出脾脏,用基础培养基洗涤,并仔细去掉周围附着的结缔组织;随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。用研磨棒挤压,使脾细胞充分释放,制成脾细胞悬液。
 
3 饲养细胞的制备
取一只成熟健康的ICR小鼠,摘眼球采血作为阴性血清,颈脱臼处死;体表消毒和固定后,暴露腹膜,酒精棉球消毒腹膜;用l0 mL注射器,12#针头,吸取10 mL HAT培养基到腹腔,右手固定注射器,左手持酒精棉球轻轻腹部,抽回腹腔内液体,注入己准备好的容器中。
 
4 融合
将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 mL的带盖的融合管中,1000 rpm离心10 min,弃上清。将融合管置于手掌中,轻轻摩擦底部,使两种细胞充分混匀;在37°C水浴中45 s内缓慢加入1 mL预热的PEG-1500到融合管中,边加边轻轻摇匀;随即在90 s内先慢后快滴加30 mL 37°C预热的不完全DMEM培养基,使PEG稀释而失去作用,37°C静置10 min,1000 rpm离心10 min;弃上清,用60 mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞,再加入适量的腹腔巨噬细胞;分装于96孔细胞培养板,然后将培养板置37°C 6% CO2培养箱内培养;5 d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基;10 d后用预热的HT换出HAT;观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时,吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。
 
杂交瘤细胞的克隆化及建株
采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数,取100个细胞放入5 mL含饲养细胞的培养液中,即20个细胞/mL,100 μL/孔滴加于96孔细胞培养板,即每孔1个细胞:再将余下的细胞悬液倍比稀释,细胞数为10 个/mL,100 μL /孔滴加于96孔细胞培养板,即每孔0.5个细胞。第8~9 d时,肉眼可见细胞克隆,对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆,判为阳性的细胞株扩大培养,建株冻存。
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