三是需要转录的 DNA 序列的下游端不要是 3’突出。如果是 3’突出
(比如选择了 Pst I 来线性化质粒),则*好用 T4 DNA 聚合酶修平。
四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般 要使用大量的 RNase A,因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染, 所以在用作模板前,采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量 总 RNA 一起保温,然后电泳检测 RNA 是否被降解,以此来判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。如果有 RNase 污染,则必须反复酚-氯仿抽提 去除残留的 RNase,然后再乙醇沉淀质粒 DNA。
二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中,在室温下(不是在 4℃下)分别按次 序加入下列成分(T7 转录预配液容易产生结晶沉淀,一定要握在手中直到 结晶彻底溶解并摇匀后方可使用):
成分 | 样品管 |
DNA 模板 | 50 ng 左右(对PCR片段) 1 ug 左右(对线状质粒) |
T7-SP6转录预配液,2× | 10ul |
T7 RNA 聚合酶-RI混合液 | 1 uL |
RNase-free 水 | 补水到 20uL |
注:此为 20uL 反应体系的用量,对其他反应体系,各成分的用量可以 按比例增减。本产品的 T7 转录预配液已经含有 NTP。如果需要标记 RNA 探针,则需要订购 NTP 分开的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA,则需 要加入自备的加帽修饰核苷酸(NEB公司有此产品)。
2.37℃保温 1-2 小时。注意:延长保温时间并不能大幅提高产量。
3.70℃加热 10 分钟灭活 T7 RNA 聚合酶。(70℃加热 10 分钟有可能使
RNA降解,尤其是在有残留RNase污染时)或加入2uL自备的500mM的EDTA溶液灭活。如果下步需要灭活DNase,则此步可以不处理,在灭活DNase时一并去除。
4.取 1-3 uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5.得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板,请按下面步骤操作三、去除 DNA 模板(所需试剂需要另购)
1.在体外转录体系中加入 1 uL 自备的 RNase-free DNase (3-5 U/uL)。