蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书

阅读次数：2882 发布时间：2020/12/3 11:20:42

蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书微量法 100T/96S 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。测定意义： SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP 还能催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。测定原理： SP 能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6- 磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP+生成 NADPH，导致 340nm 光吸收值增加。测定 340nm 吸光度增加速率，即可计算 SP 活性。自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。试剂组成和配制：提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。缓冲液：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体 1.5mL×1 支，4℃保存。试剂三：液体 1mL×1 支，4℃保存。试剂四：粉剂 1 支，-20℃避光保存，临用前加 1mL 双蒸水溶解。试剂五：粉剂 1 支，-20℃避光保存，临用前加 1mL 双蒸水溶解。试剂六：粉剂 1 支，-20℃避光保存，临用前加 2mL 双蒸水溶解。试剂七：粉剂 1 支，-20℃避光保存，临用前加 2mL 双蒸水溶解。粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。测定操作表： 1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm。 2、操作表对照管测定管缓冲液（μL） 85 65 试剂一（μL） 50 50 试剂二（μL） 3 3 试剂三（μL） 2 2 试剂四（μL） 10 10 试剂五（μL） 10 10 试剂六（μL） 20 20 试剂七（μL） 20 20 混匀，37℃水浴预热 5min 样本（μL） 20 迅速混匀，于微量石英比色皿/96 孔板，对照管调零，测定 340nm 的初始值 A1，测定完立即放入 37℃水浴准确反应 2min，对照管调零，迅速测定 340nm 吸光值 A2，△ A= A2- A1。 SP 活性计算公式： a.用微量石英比色皿测定的计算公式 1. 按照蛋白浓度计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/mg prot）= d A    ×V 反总÷V 样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr 2. 按照样本质量计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/g）= d A    ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=804×△A÷W 3. 按照细胞数量计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/104 cell）= d A    ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量（万个）)÷T=804×△ A÷细胞数量（万个）  ：NADPH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.2mL；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，2min b.用 96 孔板测定的计算公式 1. 按照蛋白浓度计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/mg prot）= d A    ×V 反总÷V 样÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr 3. 按照样本质量计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/g）= d A    ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=1608×△A÷W 3. 按照细胞数量计算酶活定义：37℃，pH6.8 时，每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/104 cell）= d A    ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量（万个）)÷T=1608× △A÷细胞数量（万个）  ：NADPH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.2mL；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，2min 注意事项： 1. 粉剂-20℃保存，配制好的试剂 3 天内使用完。 2. 可选用 BCA 法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。

原创作者：上海雅吉生物科技有限公司

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