一、稀释PCR 阳性对照(以10E1-10E6 拷贝/μL 这6个10倍稀释度为例) 如果做定性实验,则此步可以跳过。如果做定量实验,则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品只提供 DNA 片段作为阳性对照。 1. 标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。 2. 用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 用模板稀释液(好用带芯枪头,下同)。 3. 在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟, 得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头,在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 5. 换枪头,在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。 二、样品 DNA 的制备 7. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是样品制备 PC(样品制备阳性对照),一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。 8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。 三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行) 9. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记 N+9个PCR 管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR 阳性对照(用第4号管中的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤, 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设 置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加): 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性对照管 | 标准曲线 样品管(1-6 管) | 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各 10μL | 变异链球菌探针法qPCR 引物混合液-探针混合液 | 3μL | 3μL | 各 3μL | N+2 个待测 DNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 | 超纯水 | 不加 | 7μL | 不加 | 第 6 步所得标准曲线样品稀释液(1-6 号) | 不加 | 不加 | 各7μL(1 号样到1 号管,2 号样到2 号管…) | 11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR: 过程 | 温度 | 时间 | 预变性 | 95℃ | 5min | qPCR 反应 (40 个循环) | 95℃ | 15sec | 60℃ | 1min(采集 FAM 通道的荧光信号) | 四、数据处理 12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。 13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 35。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。 |