| 质粒提取步骤 一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、操作步骤： 1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8µl 相应抗生素，可适量多加； 2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）； 3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，室温10000rpm离心2min，去上清；（可重复步骤2，直至菌液离心完）（去上清时用纸吸一下） 4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体菌体； 5. 向离心管中加入250µl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度） 6. 向离心管中加入350µl Buffer N3， 立即温和地上下颠倒混匀4~6次，此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min； 7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min，至裂解物全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液； 8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液； 9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）； 10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风4min左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）； 11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70μl即可），室温静置2min。10000rpm离心1min； 12. 把液体倒回吸附柱，在10000rpm离心1min； 13. 混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。 三、注意事项： 1.使用之，把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。 2.Buffer EB在65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。 原创作者：上海雅吉生物科技有限公司 |
