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有了这一篇,再也不用问别人,WB蛋白样品制备常见问题大全! |
阅读次数:5451 发布时间:2021/9/8 9:05:46 |
一直都在做蛋白研究,但是样品制备中的小细节你都了解吗?这里为大家整理了蛋白样品制备中大大小小的常见问题,一起来学习吧! 两种方式都是可行的,各有利弊。不必担心刮刀收集会刮坏细胞,胰酶消化的程度掌握不好,也会让细胞破损。胰酶消化可能会对某些膜蛋白产生影响,刮刀收集效率会略低,可根据自己的实验来选择细胞收集的方式。做总蛋白提取时,可选择直接在器皿中进行裂解,无需提收集。 PS:使用刮刀收集时,可加入PBS帮助收取细胞。 当然不是,要根据WB的实验目的来确定提取哪类蛋白,如需验证某些低丰度蛋白,或蛋白定位,或组分间表达量对比,则需要进行亚细胞结构分离或组分分离。 蛋白样品如果期保存,或者下游实验过程较长,建议加入蛋白酶抑制剂。做磷酸化研究,一定要加入磷酸酶抑制剂! 内源性蛋白酶存在于胞浆中,所以要在细胞裂解加入抑制剂到达佳抑制效果,提取时将抑制剂添加到裂解液中,工作浓度1X。例如100X蛋白酶抑制剂,1ml裂解液中添加10ul即可。 用RIPA提取总蛋白为什么会有粘稠的不可溶沉淀?是什么?如何解决?产生粘稠物的主要原因是RIPA不能将所有样品全部裂解,产生的不可溶组分中主要含有核酸残团,细胞碎片(有些组织样品还含有油脂),和部分蛋白,因此RIPA提取的仅仅是可溶性蛋白,并非真正的总蛋白。 解决方案:使用柱式法蛋白提取真正意义上的总蛋白 浓度测定方法很多,目推荐使用兼容性较好的BCA法进行浓度测定。 蛋白样品不建议久存,也不要反复冻融。下游做WB实验,建议蛋白浓度测定后,加入loading buffer煮样,煮后根据实验需要分装成小管在-80℃,下次使用拿出小管再次煮样即可。 蛋白浓度测定后,建议将各个样品稀释到某一固定浓度(稀释可以PBS,水或裂解液),加入loading buffer后,在沸水中煮3-5分钟,使蛋白充分变性,也可使用PCR仪95度加热5分钟。 PS:煮沸并非必须步骤,膜蛋白建议70℃或者更低温度煮。 煮后在冰上静置少许时间,进行低速离心,即可上样。 如组织样品中含血较多,血红蛋白可能会影响下游实验, 可以在组织样品裂解使用红细胞裂解液进行处理后,再进行蛋白提取。 原创作者:上海雅吉生物科技有限公司 |
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