如何获取这些信息呢?重要的方法当然是文献查询(此处省略若干字),文献中查不到的内容怎么办?我们还可以借助信息生物学方法及一些产品信息帮助我们获取信息。
比如维基百科,NCBI,ExPASy等进行查询。
当然还可以利用一些产品信息进行查询。(以下是偷懒的方法,罪过罪过)
了解了目标蛋白以上内容后,我们如何对WB进行设计呢?
1.先明确好实验目的,为什么要做这个WB实验?要验证哪些问题?
想证明这个已知蛋白的表达?还是要做目标蛋白在细胞几个不同组分中表达量的对比?或者是进行蛋白定位或研究蛋白转运过程?
2.明确好实验目的后,根据查询的目标蛋白的表达量情况及细胞定位,确定提取哪部分的蛋白,用什么方法进行提取?
例如:
*目标蛋白表达量不高,且是小分子量蛋白,或是膜蛋白,想证明蛋白的表达,这类蛋白很难提取,容易丢失在RIPA不可溶组分中, 那么就要选择更合适的柱式法进行总蛋白提取。
*目标蛋白在胞质和胞核内均有表达,想验证目标蛋白在两个不同组分中表达量的对比,那就需要进行细胞样品的胞质胞核组分分离,分别用胞质和胞核蛋白组分检测。
*目标蛋白在内质网上,蛋白表达量较低,用总蛋白验证检测条带较弱,需要进行细胞样品内质网蛋白富集后再检测,提高检出效率。
*研究蛋白定位或研究蛋白转运过程,那就需要进行细胞组分分离,那就分别检测细胞核,细胞浆,细胞器,细胞膜,内体等组分。
3.蛋白制备方法考虑好后,要根据目标蛋白分子量及定位选择相应的内参,并确定使用多大的胶进行SDS-PAGE,使用蛋白Marker的分子量范围。