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WB你需要做一次WB设计!

阅读次数:3053  发布时间:2021/9/8 9:13:26
 做WB实验常常感觉在玩一场“躲猫猫”的游戏,条带不知道跑到哪里去了,怎么找就是不出来!做了很多优化调整,请教了数位师哥师姐,隔壁师姐还是做不好,一直处于“摸瞎瞎”状态,没有进展,这是为什么?

 

其实做WB,你需要做一次WB设计!没听错,装修需要设计,WB也需要设计!那如何做这个设计呢?

 

件要做的事情就是知己知彼!

 

了解你的目标蛋白

 

我们需要了解目标蛋白哪些信息呢?

 

  1. 目标蛋白的名字

  2. 目标蛋白在哪些组织中表达,是否具有特异性

  3. 目标蛋白的分子量

  4. 目标蛋白在细胞中的表达位置及表达量

  5. 是否有相应的抗体

 

如何获取这些信息呢?重要的方法当然是文献查询(此处省略若干字),文献中查不到的内容怎么办?我们还可以借助信息生物学方法及一些产品信息帮助我们获取信息。


比如维基百科,NCBI,ExPASy等进行查询。

 

当然还可以利用一些产品信息进行查询。(以下是偷懒的方法,罪过罪过)

 

了解了目标蛋白以上内容后,我们如何对WB进行设计呢?

 

 

WB设计

 

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1.先明确好实验目的,为什么要做这个WB实验?要验证哪些问题?

想证明这个已知蛋白的表达?还是要做目标蛋白在细胞几个不同组分中表达量的对比?或者是进行蛋白定位或研究蛋白转运过程?


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2.明确好实验目的后,根据查询的目标蛋白的表达量情况及细胞定位,确定提取哪部分的蛋白用什么方法进行提取

 

例如:

*目标蛋白表达量不高,且是小分子量蛋白,或是膜蛋白,想证明蛋白的表达,这类蛋白很难提取,容易丢失在RIPA不可溶组分中, 那么就要选择更合适的柱式法进行总蛋白提取。

 

*目标蛋白在胞质和胞核内均有表达,想验证目标蛋白在两个不同组分中表达量的对比,那就需要进行细胞样品的胞质胞核组分分离,分别用胞质和胞核蛋白组分检测。

 

*目标蛋白在内质网上,蛋白表达量较低,用总蛋白验证检测条带较弱,需要进行细胞样品内质网蛋白富集后再检测,提高检出效率。

 

*研究蛋白定位或研究蛋白转运过程,那就需要进行细胞组分分离,那就分别检测细胞核,细胞浆,细胞器,细胞膜,内体等组分。

 

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3.蛋白制备方法考虑好后,要根据目标蛋白分子量及定位选择相应的内参,并确定使用多大的胶进行SDS-PAGE,使用蛋白Marker的分子量范围。



 

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4.根据实验目的,设计对照及上样顺序
例如:做目标蛋白在胞质胞核中表达量对比实验,先我们将胞质和胞核蛋白分离,确定对照组的顺序后,胞质胞核蛋白样品应同时上样到一块胶中,这样WB所有条件一致,才可说明蛋白表达量的差异和趋势,若在不同胶中,孵育曝光等条件无法统一,得出的结论会导致偏差。另外,做组分分离的实验加一组Total蛋白,作为对照更为严谨。

原创作者:上海雅吉生物科技有限公司

上海雅吉生物科技有限公司主营:ELISA试剂盒,免疫组化试剂盒,PCR检测盒,金标试纸,发光试剂盒,抗体,血清,细胞等
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