脑组织分离的单细胞(单细胞分离试剂盒Cat#CS-031)
RIPA强/ RIPA /RIPA弱/SD-001 四种
20ul脑细胞分别加入200ul不同裂解液,孵育15分钟,离心10分钟
图中可见,RIPA强,RIPA,RIPA弱三管提取物管底均有明显的白色沉淀团(RIPA不可溶组分),对应裂解液强度不同,RIPA弱沉淀团大,其次为RIPA,再次为RIPA强,SD-001提取物管底无肉眼可见沉淀。
RIPA提取物产生的不可溶组分,再次加入SD-001溶解液裂解后,离心5分钟,RIPA不可溶组分底溶解,无沉淀。
RIPA不可溶组分的进一步研究:
使用RIPA和柱式法SD-001提取小鼠脾脏及肝脏总蛋白,第1道柱式法SD-001,第2道RIPA可溶组分,第3道RIPA不可溶组分再次使用SD-001提取后,进行SDS-PAGE,考染检测结果如下。
Li Q,(2016). Pitfalls of Protein Extraction by RIPA Buffer. BioTechniques 61:327 .doi 10.2144/000114486
经过进一步对沉淀团的研究我们得到了如下结论:
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RIPA不可溶组分中(3道)含有蛋白
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所含蛋白具有随机性,不可控性
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RIPA不可溶组分与可溶组分的蛋白谱有显著差异(非等比)
不同裂解液配方对蛋白的溶出效率有所不同,溶出效率越差,蛋白损失越多,不同的裂解液提取到的蛋白谱有差异,终对下游实验会产生影响。(细胞凋亡,磷酸化检测,激酶活性检测,细胞外基质,WB内参不齐,LC3指标不出等等)
扫码查看案例解析RIPA提蛋白对下游实验有哪些影响
溶液法(RIPA强) 柱式法(SD-001裂解液+离心管柱)
溶液法:15mg组织+150ulRIPA,研磨孵育15分钟,离心10分钟
柱式法:15mg+150ulSD-001裂解液,柱上研磨,离心30
溶液法:提取后有较多的不可溶组分,特别是脑组织样品,难以吸取
柱式法:无明显不可溶组分
BCA检测结果:
得率计算:
| 肾脏 (RIPA) | 肾脏 (柱式法) | 脑 (RIPA) | 脑 (柱式法) |
体积 | 100ul | 130ul | 75ul | 130ul |
浓度 | 低 | 高 | 低 | 高 |
得率 | 低 | 高 | 低 | 高 |
不同的提取方法所得到的蛋白质量(得率,杂质,蛋白谱)有明显的差异,得率低,杂质多,蛋白谱差异都会影响下游实验,出现结果异常。
PS:
BCA检测时,标曲对照一定要加入裂解液进行检测,以免出现偏差。(我们发现有裂解液加入BCA工作液就变色的情况哦~)
WB样品制备的关键:
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获取大的蛋白质溶解度,减少蛋白质损失以及尽量去除杂质。
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获取给定样品中完整的蛋白质图谱,要真实的反映所有蛋白质种类和比例。获得真实意义上的总蛋白,并非RIPA可溶性组分。
MinuteTM 动物细胞/组织样品总蛋白提取
SD-001/SN-002
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优化的裂解液配方有效解决蛋白溶解度差,丢失蛋白问题,得率更高。
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含变性、天然两款裂解液,应对不同下游实验。
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离心管柱技术,有效去除粘稠物杂质等,让蛋白样品更干净。
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1分钟一管式操作获取真正意义上的总蛋白谱,让蛋白实验赢在起跑线!
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