试剂一:葡萄糖 9mg×1支,4℃保存;临用加入1ml蒸馏水充分溶解为50μmol/mL 葡萄糖溶液, 用蒸馏水稀释为 0.5μmol/mL 葡萄糖溶液-20℃ 保存;
试剂二:液体 10mL×1 瓶,4℃保存; 试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃保存;
产品说明:
葡萄糖不仅是细胞能量代谢的主要底物,而且其代谢中间产物是生物合成的重要底物。植物可通过光合作用产生葡萄糖。就哺乳动物而言,葡萄糖不仅是大脑神经系统、肌肉、脂肪组织等的能源,而且与还原性辅酶、乳糖和乳脂的合成密切相关。
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并产生过氧化氢;过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-
氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵和蒸馏水。
操作步骤:
一、 葡萄糖提取:
组织的处理:按照组织质量(g):蒸馏水体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 蒸馏水),研磨成匀浆,95℃水浴 10 分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g, 25℃离心 10min,取上清液备用。
细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个): 蒸馏水体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏水),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复 30 次),95℃水浴 10 分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g,25℃离心 10min,取上清液备用。
二、测定步骤:
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 505nm,蒸馏水调零。
2、混合试剂的配制:使用将试剂二和试剂三 1:1 等体积混合,用多少配多少。
3、加样表(在EP 管/96 孔板中加入下列试剂):
试剂(μL) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
样本 | | | 20 |
试剂一 | | 20 | |
蒸馏水 | 20 | | |
混合试剂 | 180 | 180 | 180 |
混匀,置37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中,保温15min,于505nm 波长处读取