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CCK-8实验原理及常见问题大盘点 帮你排雷避坑 |
| 阅读次数：3293 发布时间：2024/3/15 9:19:37 |
做实验可不能光是埋头苦干，还要学会运用合适的检测试剂盒，这样就能事半功倍。如果你还在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小时才能得到的结果用 CCK-8 只需 1 小时，CCK-8 可用于细胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即开即用，检测时间大概在 1 小时左右。
CCK8是什么
CCK-8的英文全称是Cell Counting Kit-8，也就是进行细胞计数的一个盒子。那它的用途也就大致可以猜到，和细胞增殖、细胞毒性相关的实验都可以。
CCK8的原理
在CCK-8试剂盒中，主要的化学药品是WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它的核心基团和MTT是一样的，是MTT的升版本。在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。
所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。为什么是粗略的呢，因为这里没有考虑到细胞代谢水平的高低，有些细胞在药物处理后，可能活细胞数不变，但是代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。
CCK-8 检测细胞活性原理图
CCK8的用途
1.细胞增殖测定：细胞增殖实验在很多域都会用到，比如肿瘤相关、损伤后修复等。
2.药物筛选：在测定一个药物的毒性和安全有效浓度时，经常会用到CCK-8。
3.细胞毒性测定：这个可以和各个处理因素对细胞活性和增殖的影响，比如在UV、低氧或者什么化学物品对细胞的影响A上。
4.肿瘤药敏试验：做肿瘤的团队用的是比较多的，CCK-8都是一整箱的买。
5.微生物对细胞的毒性或增殖的实验。
CCK方法的优势
CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
优点：
1.酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰；
2.细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到佳测定时间。
CCK8实验常见的问题：
Q1 :做细胞活性检测时，每孔应该接种多少个细胞？
A1：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的小接种量至少为1,000个/孔(100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100 μL培养基)。
Q2:在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A2:可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
Q3:培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？
A3：不会的，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不会对检测造成影响。
Q4: 只可以在450nm波长处测OD值吗？
A4：可以在450nm波长处测OD值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度高。
Q5: 若是暂不检测OD值，该如何处理？
A5：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
Q6: 在实验中OD值太高，怎么解决？
A6：可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。此外，可适当减少细胞的数量。
Q7: 如果OD值太低，怎么解决？
A7：可以采取2个办法：1、适当增加细胞数量 2、延长加入CCK-8试剂后的反应时间。
Q8: 应该每次做标准曲线吗？
A8: 建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q9:有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A9：能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量。
Q10: 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
A10：悬浮细胞由于显色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q11:CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性
A11: 有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
Q12: CCK-8能否检测细菌细胞？
A12: 可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
Q13: 如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
A13: 还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。
Q14: 如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
A14: 可以在加样用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样
Q15: CCK-8是什么颜色？
A15： 应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
Q16: CCK-8能否对活细胞进行染色？
A16：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
Q17: CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
A17: CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力
Q18: 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A18: 有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之更换培养基，去掉药物的影响。
Q19: 每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
A19: 可能会有以下几个原因：1. 当在培养箱内培养时，培养板外一圈的孔容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2. 有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔 范围内摸索条件。
Q20: 如何设定空白对照？
A20: 在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
Q21: 哪些物质会影响CCK8的测定？
A21: 当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
Q22: 在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A22: 可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如: 可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
Q23: 设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
A23: 不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
Q24: 说明书上仅写了96孔板的测定方法.如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CC K-8试剂？
A24: 一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.
Q25: 在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
A25: 有以下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
Q26: 必须预培养细胞吗？
A26: 不一定。如果要想保持细胞的状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养 ，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q27: 如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
A27: 金属对CCK-8显色有影响。浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降。如果浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
Q28: CCK-8试剂的保存条件？
A28: 在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
Q29: 预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
A29: 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长qi的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
Q30: CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A30: 不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
Q31:悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
A31: 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q32: 有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A32: 不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
Q33: 实验之，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
A33: 需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
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