葡萄糖-6-磷酸( Glucose -6-phosphate,6PG)含量测定试剂盒说明书
分光法50管/24样 注 意 :正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: 6PG (Glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸,又称6-磷酸葡萄糖),是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物,广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的一步反应中,葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸,以继续糖酵解的其它步骤;而在戊糖磷酸途径中,葡萄糖-6-磷酸是其一个底物,该过程也是生成NADPH的主要途径。此外,葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。 测定原理: 6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色,在450 nm下测定吸光值。 需自备的仪器和用品: 分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:液体60 mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体30mL×1瓶, 4℃保存; 试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存; 试剂三:液体3mL×1瓶, 4℃避光保存。 6PG提取: 1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次), 8000g,25℃离心10min,取上清待测。 2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,8000g,25℃离心10min,取上清待测。 3、血清(浆)等液体样品:直接测定。 测定步骤: 1、分光光度计预热30min以上,调节波长至450nm,蒸馏水调零。 2、试剂二的配制:临用加入8mL水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存; 3、工作液的配制:临用按照样本数量,按以下比例配制工作液 试剂名称(μL) | 测定工作液 | 对照工作液 | 试剂一 | 500 | 500 | 试剂二 | 250 | | 水 | | 250 | 试剂三 | 50 | 50 | 4、样本测定 按下表在比色皿中加入如下试剂 试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 样本 | 250 | 250 | 测定工作液 | 750 | | 对照工作液 | | 750 | 37℃避光孵育30min,450nm下测定吸光值A测定与A对照,△A=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 6PG含量计算: 1、标准条件下测定回归方程为y = 7.7178x - 0.0016,R2 = 0.997; x为6PG含量(μmol/mL),y为吸光值。 2、按照血清(浆)体积计算 6PG含量(nmol/mL)= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷×V1×1000 =129.6×(△A+0.0016) 3、按照蛋白浓度计算 6PG含量(nmol/mg prot)= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷(V1×Cpr)×1000 =129.6×(△A+0.0016) ÷Cpr 4、按照样品质量计算 6PG含量(nmol/g鲜重)= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷(W ×V1÷V2)×1000 =129.6×(△A+0.0016) ÷W 3、按照细菌或细胞密度计算 6PG含量(nmol/104 cell)= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷(500×V1÷V2)×1000 =0.259×(△A+0.0016) V1:加入反应体系中样本体积,0.25mL;V2:加入提取液体积,1 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;1000,μmol到nmol的换算系数。 原创作者:上海雅吉生物科技有限公司 |