试剂盒说明书 分光光度法 50管/48样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CAD是木质素生物合成途径中的关键酶，是木质素单体合成反应中的后一步，催化多种不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
测定原理：
CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH，在340nm下测定NADPH生成速率，即可反映CAD活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体60mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂二中加入25mL试剂一充分溶解混匀，室温使用涡旋振荡仪振荡溶解15min，如未溶解可适当延长振荡时间；置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后24h内用完）；
（2）在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL试剂二，混匀，立即记录340nm处初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
CAD活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.286×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
