）试剂盒说明书 分光光度法50管/48样
注 意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。
测定原理：
VB1在碱性条件下还原铁氰化甲生成亚铁氰化甲，亚铁氰化甲与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体12mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
样本处理：
1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3，间隔7，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。
测定操作：
| | 空白管 | 测定管 |
| 样品（μL） | | 100 |
| 试剂一（μL） | 100 | |
| 试剂二（μL） | 80 | 80 |
| 试剂三（μL） | 100 | 100 |
| 充分混匀，80℃反应10min |
| 提取液（μL） | 80 | 80 |
| 试剂四（μL） | 220 | 220 |
| 试剂五（μL） | 120 | 120 |
| H2O（μL） | 300 | 300 |
| 充分混匀，静置20min，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。 |
计算公式：
标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr
= 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017
= 58.8×（△A-0.0031）
V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项：
1. 若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 显色完成后立即进行测定。
4. 标准曲线线性范围为0.1-10μg/mL。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
