试剂盒说明书 分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的关键酶。
测定原理：
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体45 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：液体41μL×1支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；
样本的处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：临用将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、 试剂四的配制：临用加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4、 将工作液和试剂四置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
5、 在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂四和900μL工作液，立即混匀，记录340nm处初
始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
PEPCK活性计算：
1、血清（浆）PEPCK活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=3215×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PEPCK活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
