线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书 分光光度法25管/24样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。
测定原理：
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：0.5 mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂七：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；
样本的处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10，重复30次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃
（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在1mL玻璃比色皿中加入40μL样本、100μL试剂七和800μL工作液，立即混匀，记录605nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅱ活力单位的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=113×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =0.226×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.4×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
