果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒说明书 分光光度法50管/48样 注 意 :正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶。 测定原理: PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:60mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体40mL×1瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用加入2.8mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融; 试剂三:粉剂×1支,4℃保存,临用加入260μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融; 试剂四:液体16μL×1支,4℃保存,临用加入260μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融; 样本的处理: 1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为1000~5000:1的比例(建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 3、血清(浆)样品:直接检测。 测定步骤和加样表: 1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2、工作液(可测25个样)的配制:取19mL试剂一和1.26mL试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融; 3、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。 4、加样表: 试剂名称(μL) | 测定管 | 工作液 | 800 | 样本 | 30 | 试剂三 | 5 | 试剂四 | 5 | 将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在340 nm波长下20时的初始吸光度A1和10分20时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。 注意:不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之请做1-2只预试,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。 PFK活力单位的计算: 1、血清(浆)PFK活力的计算: 单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。 PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=450×ΔA 2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算: (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。 PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。 PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=450×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。 PFK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.225×ΔA V反总:反应体系总体积,8.4×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。 原创作者:上海雅吉生物科技有限公司 |