试剂盒说明书 分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖异生过程的一个限速酶，在保血糖的动态平衡方面起着重要的作用。
测定原理：
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体47 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：液体32.8μL×1支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；
样本的处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3，间隔10，重复30次），用于线粒体PC活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：临用将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、 试剂四的配制：在试剂四瓶中加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4、 在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂四和900μL工作液，立即混匀，记录340nm处初
始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.5，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
PC活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
