葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样 注 意:正式测定取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: GOD(EC 1.1.3.4)广泛存在于动物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生H2O2,是生物体中产生活性氧的代谢途径。 测定原理: GOD催化产生H2O2,过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在500 nm有特征吸收峰,颜色深浅与GOD活性成线性关系。 试验中所需的仪器和设备: 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水 试剂的组成和配制: 提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存; 缓冲液:液体50mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用加入20mL缓冲液充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一个月; 试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用加入20mL缓冲液充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一个月; 样品测定的准备: 1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 测定步骤: 1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。 2、 试剂一和试剂二的配制:参见试剂的组成和配制。 3、煮沸样本的准备:取500μL样本至新的EP管中,95℃水浴10min,冷却至室温后,8000g 4℃离心10min,取上清作为对照管的煮沸样本待测。 4、测定操作表 试剂(μL) | 对照管 | 测定管 | 样本 | | 250 | 煮沸样本 | 250 | | 试剂一 | 375 | 375 | 试剂二 | 375 | 375 | 混匀,35'C保温15min后,于500nm波长处读取吸光度。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。 GOD活力单位的计算 1、标准条件下测定回归方程为y = 2.8348x - 0.0169;x为H2O2标准品浓度(μmol/mL),y为ΔA。 1、血清(浆)GOD活力的计算 单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。 GOD(nmol/min/mL)= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷V样÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169) 2、细菌、细胞或组织GOD活力的计算 (1)按蛋白浓度计算 单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。 GOD(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(V样×Cpr) ×1000÷T =58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr (2)按样本鲜重计算 单位定义:每g组织每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。 GOD(nmol/min/g鲜重)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(W×V样÷V样总) ×1000÷T =58.8×(ΔA+0.0169)÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位定义:每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。 GOD(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(500×V样÷V样总) ×1000÷T =0.118×(ΔA+0.0169) V反总:反应体系总体积,0.625mL; V样:加入样本体积,0.25mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。 原创作者:上海雅吉生物科技有限公司 |