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荧光免疫组化---成功染色的9个tips |
| 阅读次数：477 发布时间：2020/9/11 9:03:45 |
免疫染色，从一个好的组织样本开始
免疫组化和免疫组织学保存组织的两种主要方法是石蜡包埋和冷冻法。虽然没有一种适用于检测所有抗原的通用保存方法，但绝大多数可以在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片中检测到。对于FFPE组织，你的原始组织样本应该固定完全，但不要过度固定。不固定会导致组织完整性的丧失，而过度固定会导致抗原过度交联，使其在免疫染色过程中无法结合抗体。对于小块的新鲜组织（一角硬币的大小），在4%的多聚甲醛中过夜孵育，然后转移至70%的乙醇中长期储存，效果很好。对于其他应用，固定剂灌注也是可以的。
一些抗原，例如那些具有翻译后修饰残留的抗原，即使是轻微的醛固定，也无法存活。在这种情况下，组织应该迅速冷冻，低温切片，保存在-80 °C，直到在酒精或冷丙酮中固定。 快速冷冻可以防止冰晶的形成。在固定后，这些样本可以用标准的IHC或免疫组织学染色法处理。一旦石蜡包埋或冷冻样品准备好，就可以进行切片，粘于载玻片进行进一步的分析。不要忘记，对于一个控制良好的研究，需要阳性和阴性组织对照。
脱蜡和再水化
一旦石蜡包埋的组织切片在载玻片上，通过与一系列的二甲苯和醇孵育来去除石蜡。通常情况下，这包括在二甲苯中两次，然后分别是100%，95%和70%的乙醇中，每个3分钟。为了完成再水化过程，在dH2O中次清洗两次，每次5分钟。
抗原修复
脱蜡福尔马林固定的组织通常需要一个抗原修复步骤。这有助于消除在固定过程中可能产生的交联，使抗体可以更容易地达到他们的目标抗原表位。有柠檬酸盐和tris抗原修复缓冲液，而有些方法需要使用酶，如胃蛋白酶，胰蛋白酶，或蛋白酶K。
柠檬酸钠，pH 6.0，是*常用的抗原修复缓冲液。玻片置于10 mM的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸，在略低于沸点温度保持10min，冷切片*多30min。重要的是样本不要过热或加热不足，会导致不一致的免疫染色结果，所以加热过程应该使用空玻片进行优化。
微波加热模型如下：加热空玻片直到缓冲液开始沸腾。例如，调整微波炉的功率设置为30%。加热10分钟，观察。应避免剧烈煮沸。如果达到快速煮沸，移开玻片，用新鲜的室温缓冲液重复优化。把功率降低到20%，而不是30%。一旦加热程序被优化，记录下来，以同样的方式执行。
透化作用和封闭
为了染细胞核或细胞质抗原，经常需要透化作用。一旦你的组织切片已经冷却，将其置于稀释的去垢剂溶液中，如Tween-20或Triton x - 100，大约5分钟，进行透化处理。这种方式会破坏组织的细胞膜，增加细胞通透性，允许抗体达到细胞内的目标。用PBS冲洗玻片。
然后，与正常血清孵育进行封闭，10-15分钟，防止一抗和二抗的非特异性结合。
封闭血清中的抗体和其他蛋白 非特异性结合到组织切片上，有效地阻断在以后的步骤中一抗和二抗的非特异性结合。封闭血清可与二抗相同种属或者不相关种属。任何封闭溶液不能含有与一抗同种属的血清，以避免荧光二抗与之结合产生非特异性荧光。
一抗孵育
选择一抗，基于它与目的抗原的特异性，以及对IHC或免疫细胞化学的适用性。
为WB或ELISA设计的抗体可能无法识别在固定组织中交联的目标抗原。针对多个目标的一抗可合并为一种孵育液，前提是它们有不同的宿主来源，因此可以用不同的二抗来检测它们。
一抗稀释于PBS或PBS-Tween,与样本孵育于室温下一小时或4ºC过夜。对于每个实验，应该包括一个组织切片对照，与一种非特异性同型对照抗体结合，该抗体与一抗的类型相匹配(如果一抗是单克隆抗体)，但不识别目标抗原表位。同型对照有助于区分非特异性的背景荧光，从特定的荧光标记的目标抗原。如果一抗是多克隆抗体，包括一种与非特异性的、种属匹配的多克隆抗体孵育的组织切片。
冲洗
对于大多数荧光IHC实验，简单的PBS溶液可以在抗体孵育过程中很好地进行冲洗。在某些情况下，可以添加0.05%的Tween-20来帮助减少背景，但通常是不必要的。
二抗
二抗可以偶联不同的荧光团，有不同的颜色，绿色红色或蓝色。选择二抗，考虑与一抗的特异性以及需要的荧光颜色。可以一个切片使用多种颜色，通过偶联几个有差异的荧光团的二抗来实现，这些二抗根据宿主来源来区分一抗。像一抗一样，将二抗组合成一个孵育溶液。二抗在室温下避光孵育45分钟，以避免荧光团褪色。
核复染剂和封片剂
荧光核复染剂有助于识别样品中不表达你的兴趣抗原的细胞。一个好的复染剂也可以在你的组织样本内提供一些背景和结构线索。如果你没有使用蓝色通道作为你的一抗，你可以在1µg/mL DAPI中孵育你的样本，标记细胞核，持续5分钟。还可以购买含DAPI的封片剂，以节省额外的步骤。
将盖玻片盖到玻片上，使用适用于荧光显微镜的封片剂来帮助保存样品中的荧光信号。使用足够的封片剂封住盖玻片，注意消除气泡，以免图像变形或模糊。
观察
玻片在覆盖盖玻片后晾干，并在显微镜上使用适合每个荧光团的滤镜来显示荧光。你可以用多个滤镜获取同一微观区域的图像，然后将图像合并为多色效果。如果你的组织是厚的，可以用一个共聚焦荧光显微镜来获得更清晰的图像，可以在三维空间中对抗原定位进行旋转。 |
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