| 1. 肉眼及显微镜观察，确保细胞满足冷冻标准。 2.使细胞生长至对数生长晚期，若为贴壁细胞，用胰酶消化，并进行细胞技数。若为悬浮生长细胞，进行细胞计数并离心。 3.悬浮细胞的浓度为：2×106个~2×107个细胞/ml。 4.将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中，配制冻存液： （a） 加10%~20%的二甲基亚砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。 5. 用冻存液将细胞悬液按1：1的比例稀释至细胞度浓约为1×106 ~1×107 /ml ,此时DMSO的浓度为5%-10%（或甘油浓度为10-15%）。建议勿将冻存管置于冰上，减少细胞退化。使用DMSO时，室温操作30min是无害的，当使用甘油时，则对细胞是有益的。 6. 将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中，盖上盖子，拧紧，密封，注意不要太紧，避免螺旋扭曲变形。 7. 将冻存管夹在铝条上，装入储存筒中，或将其松散地排列在抽屉储存器中。 8. 将冻存管通过上述方法以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法，使冻存管达到-70℃，若*初温度为20℃，则需4~6h，但于-70℃过夜。 9.当冻存管温度达到-70℃或更低时，在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前，检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。 10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中，不要使其浸没在液氮中，将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步骤必须迅速（＜2min），因为冻存管会以越10℃/min的速度升温，如果温度上升超过-50℃，细胞会迅速恶化。 | 
