| 纤维素酶（cellulase，CL）活性测定试剂盒说明书 微量法 100 管/48 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： CL（EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化纤维素降解，是一类可广泛应用 于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。 测定原理： 采用3,5－二硝基水杨酸法测定CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸 馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存； 样品测定的准备： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。 2、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）： 混匀，40℃准确水浴 30min 后沸水浴 15min,（盖紧，防止水分散失），得糖化液 糖化液 15 15 试剂三 35 35 混匀， 沸水浴显色 15min（盖紧，防止水分散失），冷却 蒸馏水 250 250 混匀，冷却后，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，测 550nm 下吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。 试剂名称（μL） 对照管 测定管 试剂一 50 50 试剂二 200 200 蒸馏水 50 50 样本 50 煮沸的样本 50 CL 活性计算 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.3356x - 0.012；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、按照蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.012) ÷0.3356×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T =695×(ΔA+0.012) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.012) ÷0.3356×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =695×(ΔA+0.012) ÷W 4、按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.012) ÷0.3356×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =1.39×(ΔA+0.012) 1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.35mL； V 样：加入样本体积， 0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.1678x - 0.012；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、按照蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /mg prot)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T =1390×(ΔA+0.012) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T =1390×(ΔA+0.012)÷W 4、按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.012)÷0.1678×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =2.78×(ΔA+0.012) 1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.35mL； V 样：加入样本体积， 0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。 |
