| 细胞壁不溶性化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI） 试剂盒说明书 分光光度法 50 管/24 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖 代谢关键酶。根据*适 pH，Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。 AI 的*适 pH 为 3～5。AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI（B-AI）两种类型。 B-AI 存在于细胞间隙并结合在细胞壁上，主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以维 持库源之间蔗糖的浓度。 测定原理： B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物， 在 510nm 有特征光吸收，在一定范围内 510nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液 1：液体 50mL×1 瓶，4℃保存; 提取液 2：液体 50mL×1 瓶，4℃保存; 试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存; 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 25mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂 4℃ 保存; 试剂三：液体 30mL×1 瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 按照组织质量（g）：提取液 1 体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液 1），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL 蒸馏水，充 分震荡混匀，12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL 提取液 2 充分混匀，4℃浸 提过夜，12000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。 测定步骤和加样表： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 200 200 试剂一 800 试剂二 800 混匀， 37℃准确水浴 30min 后，95℃水浴 10min（盖紧，以防水分散失），流水冷却后充分 混匀（以保证浓度不变） 试剂三 500 500 混匀，95℃水浴 10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀， 510nm 处，蒸馏 水调零，记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘 以相应稀释倍数)，ΔA=A 测定-A 对照。 B-AI 活性计算： 标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值。 （1）按蛋白浓度计算： 单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 B-AI 活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr （2）按鲜重计算： 单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 B-AI 活性（μg/min/g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =20.8×(ΔA +0.001) ÷W V1：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。 |
