| 线粒体柠檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量 试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： MCA是线粒体三羧酸循环的个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成， 其含量是三羧酸循环强度的主要指标。 配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰 CoA 含量、柠檬酸合酶活性和 MCA 含量， 其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度，（2）综合分析丙 酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰 CoA 含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰 CoA 情况，（3）乙酰 CoA 含量、柠檬酸合酶活性和 MCA 含量变化可以反映三羧酸循环进 行状况。 测定原理： MCA 在柠檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，α-酮酸进一 步与苯肼反应，生成相应的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 处有吸收峰，该波长下吸光 度的变化程度可反映出 MCA 的含量。 分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、蒸 馏水。 试剂组成和配制： 酸性提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 碱性提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保 存； 标准液：液体 1mL×1 支，10μmol/mL 柠檬酸标准液，4℃保存。 线粒体中柠檬酸提取： 称 0.05~0.1g 样品（建议称 0.1g 样本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃ 离心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃离心 10min，弃上清（取 300μL 该上清 液和 300μL 碱性提取液中和后可用于细胞质 CA 含量测定）；沉淀即线粒体，向沉淀中加 入 0.5mL 酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重 复 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 碱性提取液中和，混匀，置冰上待测（不可用于蛋 白质含量测定）。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 330nm，蒸馏水调零。 2、试剂一、二和三 37℃预热 10min。 3、样本测定： 空白管和标准管只需要各做一个。 试剂名称(μL) 空白管 标准管 测定管 试剂一 60 60 60 蒸馏水 60 标准液 60 样本 60 试剂二 20 20 20 试剂三 60 60 60 充分混匀，330nm 立即测定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。 柠檬酸含量计算： （1）按蛋白浓度计算 柠檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 标准管×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管) ×V 样]÷（V 样÷Cpr）=10×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管)÷Cpr 蛋白质含量需要另外测定。 （2）按样本鲜重计算 柠檬酸含量(μ mol/g鲜重)=[C标准管×(ΔA测定管－ΔA空白管)÷(ΔA标准管－ΔA空白管) ×V 样]÷（W×V 样÷V 样总）=10×(ΔA 测定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 标准管－ΔA 空白管)÷W C 标准管：标准液浓度，10μmol/mL； V 样：加入反应体系中样本体积：0.06mL；V 样总： 加入提取液体积：1mL；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。 注意：检测限为 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鲜重。 |
