| 红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性测定试剂盒说明书 微量法 100T/48S 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的 代谢，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型，与药物代谢的去甲基化 密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使 某些药物经 CYP2B 代谢活化。 测定原理： ERND 催化红霉素释放甲醛，通过 Nash 比色测定甲醛含量，即可计算出 ERND 活性。 普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 板、蒸馏水和冰。 试剂组成和配置： 试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水溶解。 试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加 1mL 蒸馏水，充分溶解。 试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 0.5mL 蒸馏水，充分溶解。 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水 4.5mL 充分溶解。 试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂七：液体×1 瓶，4℃保存。 标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管，加入 10μl 标准液，加 990μl 蒸馏 水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。 粗酶液提取： 1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。 2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心 60min，弃上清液。 3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。 4、*终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该 待测液需当天使用。 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。 3. 对照管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 蒸馏 水，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取 出后加入 35μL 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加 入 100μL 上清液，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min， 于 412nm 测定光吸收，记为 A 对照管。 4. 测定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 试剂 四，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取 出后加入 35μL 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新 EP 管，加入 100μL 上清液，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 测定管。 5. 标准管：取 0.5mL EP 管，加入 100μL 标准品，100μL 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min， 然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 标准管。 注意：每个样品都需要做对照管。 ERND 活性计算公式： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1). 按照蛋白浓度计算: 活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。 ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管× 稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T = 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。 (2). 按照样本质量计算: 活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。 ERND 活性(nmol/min/g) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍 数÷（W×V 样）÷T = 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上 清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另 外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶 液体积，10μL=0.01mL；T：催化反应时间（min），30min。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下 (1). 按照蛋白浓度计算: 活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。 ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管× 稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T = 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。 (2). 按照样本质量计算: 活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。 ERND 活性(nmol/min/g) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍 数÷（W×V 样）÷T = 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上 清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另 外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶 液体积，10μL=0.01mL； T：催化反应时间（min），30min。 |
