1.NC膜漂洗：NC膜用TBST缓冲液漂洗一次。
2.NC膜的封闭：将转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻震荡2-3h。
3.目标靶蛋白与抗体的反应：将抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定。
4.将封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm2 NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻震荡2h。
5.洗膜：反应完毕后，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10min。
6.靶蛋白—抗复合物与二抗反应：
a:将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中，室温下轻轻震荡10min。
此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠
b:将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000。
c:将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0.1ml二抗溶液/cm2膜，封好塑料袋在室温下轻轻震荡1h。
7.剪开塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中冲洗1-5次，每次10min。
8.显色，照相保存结果。
（1）辣根过氧化物酶系统：
a：将膜放入显色液中,室温下轻轻摇动；
b：待条带出现后(约显色1-3分钟),立刻用水洗膜,然后转入PBS中；
c：照相,保存结果。
（2）AP系统
a：将膜放入碱性磷酸酶显色液中，室温下轻轻摇动；
b：待条带出现后(约显色20分钟)，将膜放入200μl 0.5 M EDTA (pH8.0)和50 ml PBS溶液中；
c：照相，保存结果。
