| Q1:我使用了你们的一种预染蛋白质标准品进行转印，发现在转印过程中条带在膜上褪色了。为什么会这样？ A1：褪色可能是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一些蛋白质从膜上洗脱造成的。染料本身不会从蛋白质上洗脱，因为它们是共价结合的。我们已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得绝佳的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后，可以用铅笔在膜上圈出预染条带，从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。 Q2：我的蛋白质标准中的几个条带在凝胶上缺失。你们能帮我排查问题吗？ A2: - *查使用的凝胶类型/凝胶百分比。可能会由于凝胶类型和/或百分比的不同而不能看到所有条带。例如，蛋白质标准品的小条带可能不能在非常低百分比的凝胶上分辨，而较高分子量条带可能不能在高百分比凝胶上分辨。
- *检查蛋白质分子量标准品的有效日期。由于蛋白质降解，过期批次可能导致条带褪色或缺失。
- *检查蛋白质分子量标准品的储存条件。不适当的储存条件会损害标准品中蛋白质的稳定性。
- *确保蛋白质分子量标准品在上样到凝胶上之未加热/煮沸。我们的蛋白质分子量标准品可直接上样，我们不建议将其加热/煮沸，因为这可能会导致标准品中的蛋白质降解。
Q3:我使用了你们的一种蛋白质标准品，并在泳道中看到了一些额外的条带。可以提供一些建议吗？ A3: - *上样时，请注意确保相邻样品泳道没有交叉污染。
- *确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致产生额外的条带，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
- *标准品储存不当或反复冻融会导致蛋白质降解。
Q4:我使用了你们的一种蛋白质标准品进行转印，发现一些小分子蛋白质条带穿过了膜。我该如何解决这个问题？ A4: - *降低电压、电流或缩短转印时间
- *确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
- *确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
- *检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么好使用0.2μm孔径的膜。
Q5:我在Tris-甘氨酸凝胶上使用了一种预染标准品，发现蛋白质的分子量与在NuPAGE Bis-Tris凝胶上的分子量不同。这是什么原因？ A5:预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料，这将导致标准品在不同的缓冲系统（即不同的凝胶）中迁移率不同。因此，使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率，但对于需要精确估算分子量的应用，应使用非预染标准品。 Q6:我使用了你们的一种蛋白质标准品进行转印，发现一些高分子蛋白质条带转印到膜上的效果很差。可以提供一些提示吗？ A6: - *增加电压、电流或转印时间
- *凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
- *甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析甲醇。
Q7:我使用了你们的一种蛋白质分子量标准品，它的条带看起来不太明显，很模糊。我该怎么操作？ A7: - *确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致模糊，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
- *条带在低百分比凝胶中不能很好地分辨。尝试使用更高百分比的凝胶。
- *如果在转膜/检测后条带看起来不明显和模糊，可能是由于抗体浓度过高。遵循制造商建议的稀释度或通过斑点印迹确定适抗体浓度。
Q8:我使用了你们的一种预染蛋白质分子量标准品进行转印，但是膜上的转印效果较差。可能出了什么问题？ A8: - *凝胶上的分子量标准品的量不足： 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议：(小型凝胶：每孔5μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔10μL（厚度1.5 mm）;•大凝胶：每孔10μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔20μL（厚度1.5 mm）)
- *转印不完全或不理想： 优化转印条件
Q9:我使用了你们的一种预染蛋白质分子量标准品，这些条带没有很好地分离。可能是什么原因造成的？ A9: - *样品被煮沸： 丢弃煮沸的分装样品。
- *使用的分子量标准品体积过大： 加入较少的体积或使用用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。
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